背景介绍

尽管全球范围内胃癌（GC）的发病率和死亡率呈下降趋势，但GC仍然是中国癌症相关死亡的第三大原因。近几十年见证了胃癌治疗的巨大进步，包括内镜切除、靶向治疗和免疫治疗 。但是，由于肿瘤的侵袭和转移，晚期患者的预后仍然很差。因此，了解肿瘤发生的分子机制对于胃癌的早期诊断和治疗具有重要意义。

M6A是真核生物RNA常见的化学修饰，m6A介导的ncRNA修饰与癌症有关。Mettl14是m6A的修饰酶复合物组分，而Mettl14介导的ncRNA m6A修饰与胃癌及的关系有待进一步研究。此次研究探索了Mettl14介导的m6A修饰的circORC5在胃癌进展中的功能机制，研究成果于2022年2月发表在国际著名学术期刊《Molecular Cancer》（IF: 27.0401）上。
（m6A-circRNA表观转录组芯片由康成生物丨数谱生物提供技术服务）

预实验

• 为了研究 Mettl14 在胃癌中的潜在作用，首先分析了来自TCGA的RNA-seq数据和免疫组织芯片的Mettl14的表达，结果显示人类胃癌组织样本中Mettl14的表达相对于正常组织降低，其低表达是胃癌患者生存率低的预后因素。

高通量筛选

• 为了研究METTL14下游的靶基因，作者在胃癌细胞中敲低了Mettl14，通过Arrraystar Human m6A-circRNA epitranscriptomic芯片筛选到898个circRNA具有m6A水平改变（FC›2, p‹0.05）。MeRIp-qpCR及qpCR实验证实Mettl14的沉默降低了circORC5 m6A水平，但增加 circORC5 表达。因此将circORC5 鉴定为 Mettl14的下游靶标。

功能研究

• Mettl14的过表达显著抑制了胃癌的生长和侵袭，而Mettl14的敲低则促进胃癌细胞的增殖和侵袭，敲低Mettl14的同时敲低circORC5，胃癌细胞的增殖和侵袭重新被抑制，说明circORC5受Mettl14调控。

机制研究

• 通过生信预测，circORC5可以结合miR-30c-2-3p。通过Ago-RIp-qpCR实验发现Ago蛋白结合circORC5 与miR-30c-2-3p。双荧光素酶报告基因实验证实circORC5可以结合miR-30c-2-3p。敲除circORC5促进miR-30c-2-3p表达，导致其靶基因AKT1S1 和 EIF4B 下调。敲除circORC5同时敲除Mettl14抑制miR-30c-2-3p 上调，说明Mettl14是circORC5上游的负调控因素。

结论

• Mettl14上调circORC5的m6A修饰水平进而抑制circORC5表达，进而导致miR-30c-2-3p上调及其靶基因AKT1S1 和 EIF4B 下调最终影响胃癌进展。

技术路线

结果展示


图1. 预实验发现Mettl14与胃癌相关

左上：TCGA数据库分析Mettl14在胃癌中显著降低。
右上：KM生存曲线分析Mettl14降低，胃癌的生存期显著下降。
左下：敲低Mettl14显著促进胃癌细胞MGC803的增殖。
右下：胃癌细胞过表达Mettl14的裸鼠成瘤实验证实敲低Mettl14显著抑制胃癌的体积。


图2. Arrraystar Human m6A-circRNA epitranscriptomic芯片筛选到circORC5

左：通过Arrraystar Human m6A-circRNA epitranscriptomic芯片筛选差异m6a修饰的circRNA结果聚类图。
中：MeRIp-qpCR结果显示circrna的m6A甲基化水平显著降低。
右：qpCR显示敲低Mettl14发现circORC5在胃癌中表达水平显著升高。


图3

左上：circORC5和 miR-30c-2-3p 之间潜在结合位点的示意图
右上：用 miR-30c-2-3p 模拟物转染 MGC-803 和 AGS 细胞后 WT luc-circORC5 或 Mut luc-circORC5 的荧光素酶活性。
左下：Ago2-RIp-qpCR 用于检测 circORC5 和 miR-30c-2-3p 在 MGC-803 细胞中的可以结合。
右下：用 si-METTL14 和（或）si-circORC5 转染对 MGC-803 和 AGS 细胞中 AKT1S1 和 EIF4B 表达影响的蛋白质印迹分析。


图4. 胃癌中 METTL14 的研究思路示意图。METTL14 增加 circORC5 的 m6A水平并抑制 circORC5表达，从而上调 miR-30c-2-3p 并下调其靶基因AKT1S1和EIF4AB，有助于抑制胃癌的发生发展

文章链接

https://molecular-cancer.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12943-022-01521-z

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