外显子组测序（ES）作为一种新兴的遗传诊断方法，正越来越多地应用于复杂疾病的诊断，包括癌症、代谢疾病和神经系统疾病。多项研究表明，外显子组测序的诊断率大约为三成。不过，荷兰内梅亨大学医学中心的研究人员近日发现，几年后重新分析测序数据，可将诊断率提高至五成。
以往，疑难杂症患者需要辗转多家医院，花费数年时间去寻找病因。外显子组测序的出现有望帮助患者结束漫长的诊断之旅。一些儿科神经病学研究表明，通过这种方式，大约三分之一的患者在分析后立即得到诊断。如果找不到原因，医生往往会建议患者：过几年再来。
随着技术的进步，外显子组测序的诊断率也会提高。改进的富集技术、优化的测序试剂以及更先进的分析工具能够发现以往无法识别的临床相关变异。此外，疾病-基因新关联的发现也可以帮助医生重新解释测序数据。
为了突出外显子组测序再分析的重要性，内梅亨大学医学中心的Lisenka Vissers教授带领团队对150名患有神经系统疾病的儿童进行了系统研究，并将研究结果发表在《Genome Medicine》杂志上。
诊断率从31%提高到53%
在第一次检测后，47名儿童立即拿到了诊断结果。对于未获得诊断结果的患者，医生建议他们随访。五年后，研究人员利用更新后的分析流程和数据库对当时的外显子组测序数据进行重新分析。若仍然未获得诊断结果，则开展系统性重新评估，也就是用新的方案开展重新测序和数据分析。
对于2015年未获基因诊断的103名患者，研究人员在重新分析数据后帮助18名患者获得了诊断结果，其中一例不是遗传病，而是获得性脑瘫。之后，他们又对其余患者开展系统性重新评估，确定了另外14例的诊断结果。因此，这个患者队列的总诊断率从31%（47/150）提高到53%（79/150）（图1）。
图1. 临床外显子组数据的三步重新分析策略
诊断率提高归因于多个因素
对于31例新的基因诊断，他们回顾了得出诊断结论的原因。总的来说，这主要归因于新的基因型-表型关联被发现（42%，13/31）。以往一些变异被认为是“意义未明的变异（VUS）”，但随着新关联的发现，它们被确定为致病变异。例如，CSNK2A1被发现与Okur-Chung神经发育综合征存在关联。另外，诊断还归因于对之前鉴定出的变异进行重新分类（10%，3/31），以及使用改进的生物信息学流程对测序数据进行重新分析（19%，6/31）。
研究人员指出，重新测序也是至关重要的，在新获得的基因诊断中占了29%（9/31）。他们认为，富集策略和测序技术的进步带来了更高质量的数据，这主要是因为覆盖度更好、更均一。例如，重新测序分析发现一个病例的可能致病变异是NUS1。该基因在原始测序数据中的覆盖很差，因此最初的再分析变异检出算法无法检出。
在此次的重新测序分析中，他们使用了Twist Bioscience的人核心外显子组 + RefSeq组合富集试剂盒，以及Illumina的NovaSeq 6000测序仪，覆盖度达到100倍。
Twist人核心外显子组捕获试剂盒高效覆盖CCDS数据库(33 Mb)和ClinVar变异株(99%)。它采用高保真双链DNA探针，具有出色的捕获覆盖均一性。同时，Twist人类RefSeq组合能够扩展核心外显子组的内容。当这两个组合结合在一起时，99%的蛋白质编码基因将被覆盖。
未来的临床再分析策略
研究人员认为，所有的再分析策略都有助于获得新的诊断。他们建议结合多种方法来进行基因诊断，包括对意义未明的变异进行随访，对数据进行重新评估，以及对样本进行重新测序。这种再分析可以是周期性的，比如一年一次或两年一次，也可以在采用新分析工具后实施。他们认为，随着技术的不断进步，包括短读长和长读长基因组测序、甲基化分析和光学图谱，未来的诊断率将不断提高。
原文检索
Schobers, G., Schieving, J.H., Yntema, H.G. et al. Reanalysis of exome negative patients with rare disease: a pragmatic workflow for diagnostic applications. Genome Med 14, 66 (2022). https://doi.org/10.1186/s13073-022-01069-z