图片:伊利诺斯州高级生物制造生物工厂(iBioFAB)通过一个名为plasmidMaker的新平台支持质粒的自动化构建。
图片提供: Center for Advanced Bioenergy and Bioproducts Innovation
质粒是重组 DNA 技术的最基本工具之一。 这些小小环状的DNA分子被研究人员用来将新的基因导入目标生物，在基础生物学和应用生物学中有着广泛的应用。在过去的二十年中，已经开发了多种用于质粒构建的创新方法。例如序列和连接独立克隆 (SLIC) 、等温 Gibson 组装 、基于尿嘧啶切除的克隆、酵母同源重组或基于限制性消化的方法如 MASTER 连接和 Golden Gate组装。尽管开发了许多 DNA 组装技术，但由于每种方法的能力和局限性不同，复杂质粒 DNA 分子的组装通常需要尝试多种技术以找到适合目标 DNA 的组装方法，或利用多步骤分层装配方案。质粒 DNA 的构建仍然是合成生物学 DBTL 循环中最耗时、最费力和最不灵活的步骤之一，阻碍了生物实验的速度和规模。多数情况下实验室之间通过赠送来互相交流质粒，但重复改造转手的质粒序列可能存在错误。有时需要从供应商处购买。
研究人员已经开发了几种策略来通过自动化构建质粒DNA来解决这一限制。例如，转录激活因子样效应核酸酶 (TALEN) 的高通量合成是通过Golden Gate组装实现质粒的自动化构建的。此外，基于网络的软件工具与使用基于 Type-IIS 限制性内切酶的模块化克隆技术的 DNA 组装协议相结合，可实现 DNA 片段的高效生产。尽管这些自动化质粒构建方法已显示出高产率和准确性，但由于使用了基于限制性消化的方法，或需要添加计算设计的接头以连接片段，这些平台在构建具有几乎任何 DNA 序列的质粒方面仍然缺乏灵活性。这种缺乏灵活性主要是由于基于限制性消化的组装方法的固有局限性，例如在感兴趣的 DNA 上存在限制性内切酶的识别序列或添加scar序列以提高 DNA 组装的效率。此外，自动化 DNA 组装的大部分进展都集中在“构建”部分，其中质粒的初始设计和最终确认是离散的。因此，非常需要开发一种 DNA 组装策略，该策略可以以高保真度和稳健性组装任何 DNA 序列，并为自动化质粒构建创建端到端渠道。
为了解决这一问题，Behnam Enghiad、Xue pu和伊利诺伊大学厄巴纳香槟分校高级生物能源和生物产品创新中心(CABBI)的其他研究人员开发了一个多功能的、自动化的质粒设计和构建平台，称为plasmidMaker。他们的研究成果最近发表在《自然通讯》杂志上。
创造质粒始于设计。为了帮助这个设计过程，plasmidMaker有一个用户友好的网页界面，研究人员可以直观地、可视化地按自己的需要来设计和组装理想的质粒。
一旦质粒设计完成，它将被提交给质粒制造团队，质粒的订单将交给伊利诺伊州生物高级生物制造工厂(iBioFAB)生产。iBioFAB位于伊大校园的卡尔R.沃斯基因组生物学研究所(IGB)，是一个完全集成的设施，支持快速制造，质量控制和遗传结构的分析，具有一个中央机械臂，可以在执行不同操作的仪器之间转移实验室仪器，如移液、孵化或热循环。
质粒构建过程是自动化的:样品通过聚合酶链反应(pCR)制备，纯化，DNA序列组装转化，质粒确认冷冻，几乎不需要人工参与。
除了iBioFAB提供的自动化和精确性，plasmidMaker平台还开创了一种新的高度灵活的方法，利用基于pfAgo的人工限制性内切酶(AREs)将多个DNA片段组装成质粒。
限制性内切酶长期以来一直用于质粒构建，因为它们可以在特定的碱基序列上切割DNA分子，称为识别序列。然而，这些识别序列通常很短，一个短序列很可能在一个DNA分子中出现多次，在这种情况下，限制性内切酶会进行太多的剪切。
“在以前的DNA组装方法中，通常很难找到合适的限制性内切酶来切割质粒并替换DNA片段，”作者之一、伊利诺伊州化学与生物分子工程(ChBE)的Steven L. Miller主席赵惠民(Huimin Zhao)说。“基于pfAgo的AREs提供了更大的灵活性和精度，因为它们可以通过编程在几乎任何位置寻找更长的识别序列。”
作为美国能源部资助的四个生物能源研究中心之一，CABBI的团队成员希望plasmidMaker能够加快合成生物学在生物技术应用方面的发展。
“这个工具将提供给CABBI的研究人员，我们希望最终使它提供给其他三个生物能源研究中心的所有研究人员，”赵说。“如果进展顺利，我们希望让世界各地的所有研究人员都能使用它。”