在AACR 2022上，全球癌症研究领域的人员齐聚一堂，分享目前取得的进展——其目标都是为了扫清深入了解癌症并最终治愈癌症之路上的种种障碍、进而惠及患者。他们的研究还证明了采用单细胞多组学和空间分析等技术创新来推动这一基本目标的价值。
我们在本文中回顾了AACR上的一些重要故事，从聚焦肿瘤微环境生物学的创新研究开始，到来源于临床试验的新型疗法开发。也欢迎扫码观看在中国召开的单细胞及空间多组学肿瘤年度峰会，了解领先的肿瘤研究人员如何使用10x Genomics的技术来推动该领域的发展。
空间CRISpR揭示在肿瘤免疫排斥中起作用的基因
肿瘤及其周围环境的组成，称为肿瘤微环境（TME），在确定癌症进展和治疗应答方面都发挥着重要作用。TME是一种复杂的混合物，其中侵袭性的癌细胞被基质和上皮细胞以及细胞外基质渗透和包围。免疫细胞，如T细胞、巨噬细胞和树突状细胞，也不时出现于其中，它们要么存在于组织中，要么被招募到肿瘤中。西奈山伊坎医学院伊坎基因组学研究所的主任Brian Brown博士在AACR的演讲中指出，免疫细胞的存在和浸润是癌症预后的关键决定因素：“如果它们不存在于肿瘤中，它们就无法杀死癌细胞——至少，我们是这么认为的。”
Brown博士的研究团队想了解肿瘤如何调控TME的细胞组成，特别是防止关键免疫细胞群的浸润。所有的生物学信息都由基因组编码，因此他们推测某些基因负责TME中细胞的调控和结构。然而，在发现和表征这些基因的同时如果要保留TME的空间结构，则带来了另一个挑战。为了实现这一分析，Brown博士的团队开发出一种改进的CRISpR技术(3)，利用高维空间免疫组化染色和Visium空间基因表达分析来观察敲除与肿瘤免疫应答（包括免疫逃逸）相关的基因后对细胞、分子和结构影响。
他们鉴定出一些特定基因，这些基因在关闭时会对TME的结构产生巨大影响。例如，TGF-b是一种与免疫抑制相关的调节细胞因子，敲除TGF-b的免疫受体Tgfbr2会导致高度纤维黏液性肿瘤结构形成，并且带有敲除基因的肿瘤病灶显著排斥免疫细胞。这是一个令人惊讶的结果——去除免疫抑制因子从表面上看应该能释放免疫反应。
然而，空间转录组学数据显示，尽管癌细胞中的Tgfbr2缺失，但TME中的成纤维细胞群却成为补偿，它们具有强化的TGF-b激活的基因表达特征。此基因通路激活后，成纤维细胞就可能实现所观察到的肿瘤免疫排斥。这一发现也补充了其他结果，解释了免疫细胞为什么并不总能有效地浸润肿瘤并杀死癌细胞，并可能指出了一条新的干预途径。
采用CellTrek和乳腺细胞图谱将单细胞数据映射到组织
为了充分了解癌症，人们通常需要对癌症发生的组织网络构建高分辨率的细胞和分子视图。德克萨斯大学MD安德森癌症中心教授Nicholas Navin博士分享了其团队构建健康乳腺细胞图谱的工作，该图谱将为癌症背景下乳腺组织的细胞异质性和空间结构提供宝贵信息。之前只有10种细胞类型被鉴定出，但通过100名女性正常乳腺组织的单细胞和单细胞核RNA测序，加上另外20个样本的空间分析，他们表征了12种细胞类型和47种不同的细胞状态。这表明乳腺小叶中存在之前未发现的富含免疫细胞的生态系统，也为乳腺组织中的脂肪细胞建立了首批参考数据。
Navin博士领导的研究团队致力于采用基因组学创新来研究乳腺癌。在AACR上，他介绍了一种称为CellTrek的计算方法，该方法提升了将单细胞数据和Visium空间数据相关联的潜力。这种计算技术的原理是将单细胞RNA测序（scRNA-seq）和空间基因表达数据共同嵌入高维空间中，让用户能够以单细胞分辨率将scRNA-seq数据映射回组织形态上的单个点。
研究团队将这种方法应用在导管原位癌（DCIS）组织上，能够分辨有着异质性表达程序的肿瘤亚克隆在导管网络中的空间分布，并观察免疫细胞在DCIS导管区域外的三级淋巴结构中的浓度(4)。这种技术有望灵活地整合单细胞和空间基因表达数据，让人们更轻松地探索组织形态中的单细胞基因特征。
让单细胞测序来推动临床研究
Navin博士还评论了单细胞测序技术在多种癌症研究应用中的价值，如追踪肿瘤克隆进化、定义癌细胞转录组特征，或以无偏的TME视角鉴定研究不多的成纤维细胞和内皮细胞中的细胞亚群。这项技术也可以扩展到肿瘤生物学的基础研究之外，具有推动临床和转化应用的潜力：
“现在是一个好时机，可以开始思考这些工具的临床应用，以及我们如何将它们用于诊断。目前有几个临床研究领域，而早期检测是一个很好的领域，我们可以开始从尿液样本中寻找早期血癌细胞，从唾液中寻找早期肺癌细胞，或研究其他体液。我们可以根据肿瘤和肿瘤微环境的图谱，使用一些方法对患者进行分层，看看哪些患者的疾病会进展，而哪些患者不会。我们还可以发现许多新的药物靶点，不仅是在肿瘤细胞中，还在微环境的组分中，并思考我们该如何治疗不同的癌症。我们还可以重建进化谱系，并了解要靶向哪些突变……”
其他几位科学家也在AACR上表达了同样的观点，他们展示了在临床样本上使用10x Genomics单细胞技术的研究，旨在加深对免疫治疗应答的细胞基础的认识，并推进个性化治疗方式，比如癌症新抗原疫苗的开发。
Deca-1 vs. Deca-2：测试两种癌症疫苗
癌症疫苗的有效性取决于什么？Genentech公司的资深首席科学家Lélia Delamarre博士分享了她对这个问题的研究，从多个层次解析了决定疫苗效力的复杂生物学。首先是鉴定合适的新抗原，也就是癌细胞上的突变蛋白，患者的免疫系统将其视为外来物和清除目标。不过根据Delamarre博士的说法，只有1%的突变具有免疫原性，能够激活免疫系统来对抗癌症。其次是这些激活的免疫系统在杀死癌细胞上的效果如何。这不是给定的——T细胞生物学和TME的某些特征实际上会削弱和减少T细胞的杀伤能力。
开发有效癌症疫苗的这些挑战最终需要大量的高分辨率抗原肽和免疫反应数据，这不仅需要改进预测模型来选择癌症新抗原，还需要了解如何招募T细胞以破坏癌细胞。于是，Delamarre博士及其团队采用了单细胞免疫分析技术，这使得他们能够利用接种疫苗产生后的免疫细胞同时构建单细胞基因表达、新抗原特异性和T细胞受体库。
他们首先开发出两种基于mRNA的疫苗并命名为Deca-1和Deca-2，每种疫苗含有10种癌症新抗原，并在引入肿瘤攻击之前将疫苗应用于小鼠作为预防性设置。单细胞数据显示这两种疫苗的CD8+ T细胞应答相当，两者都减少了肿瘤生长。不过，将疫苗应用在已有肿瘤的小鼠身上却产生了不一致的结果：Deca-2减小了肿瘤生长，而Deca-1表现不佳。这表明肿瘤的存在削弱了Deca-1引发的T细胞的抗肿瘤免疫力。
通过单细胞分析，他们能够鉴定出驱动这两种结果的分子变化：Deca-1疫苗接种诱导产生的T细胞在进入肿瘤后进一步分化，功能逐渐减弱。相比之下，Deca-2产生的T细胞在功能上更具活性和细胞毒性，表现为颗粒酶和穿孔素的大量表达。
不过，问题仍然存在——TME的哪些特征会干扰Deca-1的 T细胞？Delamarre博士指出，树突状细胞对新抗原的交叉呈递作用可能是T细胞抗肿瘤免疫力的重要维持因素。若没有这些细胞间的相互作用，T细胞最终会耗竭吗？
树突状细胞对pD-1介导的抗肿瘤免疫力至关重要
关于TME内的干扰对治疗有何影响，这个问题也是目前正在开展的一项肝细胞癌（HCC）或肝癌的检查点免疫治疗的临床研究的重点，该研究由西奈山伊坎医学院精准免疫学研究所的主任Miriam Merad博士领导。在AACR上，Merad博士介绍了与再生元制药公司以及TARGET研究团队的医生和科学家合作开展的临床试验，旨在了解应用于初治癌症的药物的抗肿瘤免疫应答。
在他们的2期临床试验中，28例患者在切除肝病灶之前两次注射了pD-1阻断剂。28% 的患者为阳性应答者，肿瘤坏死率超过50%。对患者肝病灶中的肿瘤浸润T细胞的高维免疫组化分析显示出三种不同的浸润模式：低、富含和排斥，其中应答者的病灶中富含T细胞。
为了了解这种T细胞浸润差异的分子基础，Merad博士及其团队对约100万个肿瘤浸润T细胞开展scRNA-seq、CITE-seq（细胞表面蛋白分析）以及T细胞受体测序。结果表明应答者存在高比例的辅助样CD4+ T细胞，且pD-1hi祖细胞CD8+和CD4+细胞存在明显的克隆扩增。
染色还揭示了大量的树突状细胞与CD4+ 和CD8+ T细胞紧密聚集的模式。从这些数据中获得的综合信息表明，T细胞与树突状细胞的局部相互作用促进了T细胞扩增，并吸引了CD4+ 细胞，进而维持了应答者的CD8+抗肿瘤免疫力。Merad博士团队的研究结果表明，在pD-1阻断免疫治疗后，通过调节肿瘤部位的树突状细胞有望进一步加强免疫应答。
为治愈之路扫清障碍
看到领先的癌症研究人员如何利用单细胞和空间技术来解析影响肿瘤微环境组成、肿瘤浸润以及最终治疗效果的复杂因素，令人难以置信，并深感震撼。在获得癌症生物学各个方面的多组学、高分辨率见解之后，科学家和医生建立了坚实的知识基础，努力提供改良疗法，并在患者的癌症之旅中给他们提供更大的信心和支持。
参考资料：
https://www.datadictionary.nhs.uk/nhs_business_definitions/cancer_pathway.html
Ciria-Suarez L, et al. Breast cancer patient experiences through a journey map: A qualitative study. pLOS ONE 16: e0257680 (2021). doi: 10.1371/journal.pone.0257680
Dhainaut M, et al. Spatial CRISpR genomics identifies regulators of the tumor microenvironment. Cell 185: 1223-1239.e20 (2022). doi: 10.1016/j.cell.2022.02.015
Wei R, et al. Spatial charting of single-cell transcriptomes in tissues. Nat Biotechnol (2022). doi: 10.1038/s41587-022-01233-1